Unterdrückung lokaler Entzündungen durch Galectin

Nature Biomedical Engineering (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Behandlung chronischer Entzündungen mit systemisch verabreichten entzündungshemmenden Medikamenten ist mit mittelschweren bis schweren Nebenwirkungen verbunden und die Wirksamkeit lokal verabreichter Medikamente ist nur von kurzer Dauer. Hier zeigen wir, dass Entzündungen durch ein Fusionsprotein des immunsuppressiven Enzyms Indoleamin-2,3-Dioxygenase 1 (IDO) und Galectin-3 (Gal3) lokal unterdrückt werden können. Gal3 verankert IDO im Gewebe und begrenzt so die Diffusion von IDO-Gal3 weg von der Injektionsstelle. In Nagetiermodellen für Endotoxin-induzierte Entzündungen, Psoriasis, Parodontitis und Osteoarthritis blieb das Fusionsprotein nach der Injektion etwa eine Woche lang in den entzündeten Geweben und Gelenken, und es kam zu einer Verbesserung der lokalen Entzündung, des Fortschreitens der Krankheit und der entzündlichen Schmerzen bei den Tieren mit homöostatischer Erhaltung des Gewebes und ohne globale Immunsuppression. IDO-Gal3 kann als immunmodulatorisches Enzym zur Kontrolle fokaler Entzündungen bei anderen Entzündungszuständen dienen.

Chronische Entzündungen, die durch Wechselwirkungen zwischen professionellen Immunzellen und ansässigen Gewebezellen gekennzeichnet sind, schädigen das Gewebe des Körpers irreversibel und sind ein damit verbundener Risikofaktor für eine Vielzahl von Krankheiten wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Diabetes und Krebs1,2. Eine große Herausforderung bei der Behandlung chronisch entzündlicher Erkrankungen ist die Entwicklung von Therapeutika, um die Entzündung sicher und spezifisch ortsspezifisch zu lösen1. Entzündungshemmende Medikamente wie Glukokortikoide sind pleiotrop, beeinflussen unspezifisch zahlreiche Signalwege1 und gehen daher mit Problemen der Toxizität, Resistenz und einer Vielzahl schwerwiegender Nebenwirkungen wie Infektionen und mangelhafter Wundheilung3 einher. Darüber hinaus führt die systemische Immunmodulation zu Krankheitszuständen wie Bluthochdruck, Osteoporose, Fettleibigkeit, Katarakt und Diabetes3. Biologische immunsuppressive Medikamente, die entweder durch Zytokinblockade, Zelldepletion oder Zelloberflächenrezeptorblockade wirken, bieten eine verbesserte Spezifität und können Immunantworten effektiv modulieren, um das Fortschreiten der Krankheit bei bestimmten, aber nicht allen Patienten zu stoppen4. Allerdings können solche Behandlungen auch die Anfälligkeit für Infektionen erhöhen und die Gewebehomöostase stören, was unter anderem zu Krebs, einer Verschlimmerung von Herzinsuffizienz und neurologischen Ereignissen führen kann4. Entscheidend ist, dass jedes dieser Therapeutika eine lebenslange kontinuierliche Anwendung erfordert und klinische Optionen zur Lösung chronischer Entzündungen und zur Wiederherstellung der Gewebehomöostase noch entwickelt werden müssen5.

Die Fähigkeit, den Zellstoffwechsel zu steuern, um Immunantworten zu programmieren, hat sich kürzlich als neuer Weg für die therapeutische Immunmodulation herausgestellt6. Der Katabolismus der essentiellen Aminosäure Tryptophan (Trp) durch das zytosolische Enzym Indoleamin-2,3-Dioxygenase 1 (IDO) und die daraus resultierende Produktion von Kynurenin-Metaboliten ist ein allgemeiner Entzündungsregulator als Reaktion auf sterile und pathogene Entzündungsreize und wirkt auf beide angeborenen Organe und adaptive Immunzellen7,8. Der IDO-Katabolismus von Trp trägt auch dazu bei, die Toleranz des Fötus in der Schwangerschaft zu fördern, Autoimmunität abzuwehren und die Eliminierung des Immunsystems bei einigen Krebsarten zu verhindern9. Trp-Insuffizienz über IDO aktiviert den metabolischen Stresssensor General Control Nonderepressible 2 (GCN2), um den Immunzellzyklus zu regulieren10, während Metaboliten des Kynurenin-Signalwegs entzündungshemmende Programme aktivieren, wie z. B. die Bindung von Kynurenin an den Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor (AHR)11. Es wurde gezeigt, dass die IDO-Expression in Immunzellen wie Makrophagen und dendritischen Zellen die Aktivierung und Proliferation von T-Zellen unterdrückt und gleichzeitig die phänotypische Aufrechterhaltung regulatorischer T-Zellen aktiviert und fördert12,13,14. Darüber hinaus reguliert das Endprodukt des Kynurenin-Signalwegs, Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+), die Funktion der angeborenen Immunität in Makrophagen während des Alterns und bei Entzündungen15. Insgesamt dienen die Wirkungen von IDO als Schlüsselmechanismus zur Aufrechterhaltung der Homöostase, zur Unterdrückung der Autoimmunität und zur Eindämmung übermäßiger Entzündungen9,10. Auf der Grundlage dieser Daten stellten wir uns die therapeutische Verabreichung von exogenem IDO als Regulator chronisch entzündlicher Erkrankungen vor.

Ein Haupthindernis bei der Behandlung lokalisierter Gewebeentzündungen ohne systemische Immunsuppression ist die Notwendigkeit, Therapeutika am beabsichtigten Wirkort anzusammeln. Konzeptionell ausgerichtet auf Wachstumsfaktoren und Antikörper, die entwickelt wurden, um extrazelluläre Matrixproteine ​​für eine lokale Geweberetention zu binden16,17,18,19, haben wir kürzlich die Nützlichkeit von Modellenzymen, die mit Galectin-3 (Gal3), einem Kohlenhydrat-bindenden Protein, fusioniert sind, als verallgemeinerbares Enzym demonstriert bedeutet, die Enzymdiffusion durch Bindung an Gewebeglykane einzuschränken20. Gal3 bindet N-Acetyllactosamin und andere β-Galactosid-Glykane sowie Glykosaminoglykane, die in Säugetiergeweben sehr häufig vorkommen21,22 und insgesamt ein universelleres Ziel darstellen als ein spezifisches extrazelluläres Matrixprotein. Daher stellt die Fusion von Gal3 mit Enzymen einen vielversprechenden Ansatz dar, um die lokale Enzymfunktion an einem beabsichtigten Wirkort aufrechtzuerhalten. Aufbauend auf diesem Erfolg entwickelten wir die IDO-Gal3-Fusion mit der Erwartung, ein im Gewebe verankertes IDO zu schaffen, das als lokalisiertes entzündungshemmendes Therapeutikum verabreicht wird (Abb. 1a, b). Die Wirksamkeit wird bei vier verschiedenen Entzündungszuständen beschrieben: Endotoxin-induzierte Entzündung, Psoriasis, Parodontitis und Arthrose.

a,b, Schematische Darstellung des IDO-Gal3-Fusionsproteins (a) und des Konzepts der Verankerung von IDO an verschiedenen Gewebestellen durch Gal3-vermittelte Erkennung von Gewebeglykanen (b). c,d, Charakterisierung der enzymatischen IDO-Gal3-Aktivität (c), aufgetragen als Anfangsrate (V0) vs. Substratkonzentration, wobei Anfangs- und Maximalrate (Vmax) in der Einheit U (pmol(n-Formylkynurenin) min− ausgedrückt werden 1 pmol−1(IDO)) und Bindung an immobilisierte Laktose (d). e, Zeitplan zur Bewertung der verankerten IDO-Unterdrückung von Entzündungen, die aus einer lokalen LPS-Injektion resultieren. f,g, Histologische Bewertung (f) der IDO-Gal3-Unterdrückung der durch injiziertes LPS induzierten Entzündung durch Zählung der Zellinfiltration (g). Maßstabsleiste, 50 Mikrometer. h–k, Relative Quantifizierungswerte (RQ) der Expression von Entzündungsgenen (IL-6, IFN-γ, IL-12, IL-1β) in Geweben, die vor der Belastung mit LPS mit verankertem IDO behandelt wurden. l,m, Zeitplan (l) und Psoriasis-Bereich-Schwereindex (m) zur Bewertung der verankerten IDO-Unterdrückung der durch topisches Imiquimod induzierten Entzündung. Als Kontrolle ist das Gal3-haltige Protein NanoLuc®-Luciferase-Fusion mit Gal3 (NL-Gal3) ohne IDO-Domäne enthalten. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung in c und Mittelwert ± Standardabweichung in g und m angezeigt. Statistische Analyse: (g–k) einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukeys Post-hoc. NS zeigt keinen Unterschied im Vergleich zum Vehikel an, ns zeigt keinen Unterschied im Vergleich zur LPS-Positivkontrolle an, der Balken gibt den P-Wert relativ zur LPS-Positivkontrolle an; n = 6. Für g gilt P = 0,0054, F = 6,200. Für h gilt P = 0,0040, F = 6,630. Für i ist P = 0,0006, F = 10,15. Für j ist P = 0,0898, F = 2,579. Für m, Mann-Whitney-U-Test mit Alpha = 0,05, ****P < 0,0001, n = 12.

IDO-Gal3 katalysierte die Umwandlung von Trp in Kynurenin (Abb. 1c) und band immobilisierte Laktose mit vergleichbarer Affinität wie Wildtyp-Gal3 (Abb. 1d). Die subkutane (sc) Injektion von IDO-Gal3 verhinderte Entzündungen, die durch eine lokale Lipopolysaccharid (LPS)-Belastung hervorgerufen wurden, besser als IDO allein (Abb. 1e–k). Die histologische Analyse zeigte, dass eine 24-stündige Vorbehandlung mit IDO-Gal3 die zelluläre Infiltration nach der LPS-Exposition abschwächte, während dies bei einer Vorbehandlung mit nicht verankertem IDO nicht der Fall war (Abb. 1e – g). Die Zellinfiltration von naivem Gewebe wurde im Vergleich zum Salzlösungsträger (PBS; ergänzende Abbildung 1) weder durch die sc-Injektion von IDO noch durch IDO-Gal3 beeinflusst. Die Vorbehandlung mit IDO-Gal3 blockierte die Transkription der entzündungsfördernden Zytokine IL-6, IFN-γ und IL-12p35, wohingegen die Expression nach Vorbehandlung mit IDO höher war als in der Vehikelkontrolle (Abb. 1h – j). Die IL-1β-Transkriptspiegel schwankten nach der LPS-Exposition erheblich, der Trend deutete jedoch darauf hin, dass die Vorbehandlung mit IDO-Gal3 auch die Expression dieses entzündungsfördernden Zytokins unterdrückte, während dies bei der Vorbehandlung mit IDO nicht der Fall war (Abb. 1k). Die unangefochtene Genexpression entzündlicher Zytokine im naiven Gewebe wurde weder durch IDO- noch durch IDO-Gal3-sc-Injektion im Vergleich zum Salzlösungsträger (PBS; ergänzende Abbildung 2) beeinflusst. Darüber hinaus hatte die sc-Verabreichung des Kontrollproteins NanoLuc-Fusion mit Gal3 (NL-Gal3), dem die IDO-Domäne fehlte, kaum oder gar keine Auswirkungen auf die Genexpression von naivem oder LPS-belastetem Gewebe (ergänzende Abbildung 3). Dies deutete darauf hin, dass die Gal3-Domäne in vivo keine immunmodulatorische Rolle im IDO-Gal3-Fusionsprotein spielte. Eine weitere In-vitro-Charakterisierung stimmte mit keiner Immunmodulation durch die Gal3-Fusionsdomäne überein, da die Fähigkeit von IDO-Gal3, die LPS-Aktivierung kultivierter dendritischer Zellen aus dem Knochenmark zu unterdrücken, frühere Ergebnisse mit Wildtyp-IDO allein widerspiegelte und die Behandlung mit NL-Gal3 dies tat verändert den Phänotyp dendritischer Zellen nicht (ergänzende Abbildung 4).

Die lokale Injektion von IDO-Gal3 löste auch die Entzündung in einem murinen Psoriasis-Modell auf (Abb. 1l, m). Die topische tägliche Anwendung von Imiquimod über 14 Tage löste eine Entzündung aus, die am 5. Tag ihren Höhepunkt erreichte, was sich im klinischen Schweregrad der Psoriasis widerspiegelte. Die Vehikelinjektion hatte keinen Einfluss auf den Schweregradwert, der für den verbleibenden Zeitraum von 14 Tagen erhöht blieb. Im Gegensatz dazu führte die subkutane Injektion von IDO-Gal3 am 3. Tag zu einem dramatischen Rückgang des klinischen Scores bis zum 8. Tag, der trotz fortgesetzter täglicher Imiquimod-Exposition über die gesamte Dauer niedrig blieb. Darüber hinaus zeigte die Verabreichung des Kontrollfusionsproteins NL-Gal3 keinen Einfluss auf den Schweregrad der Psoriasis (Abb. 1m), was den Hinweis bestätigt, dass die Gal3-Domäne keine immunmodulatorische Rolle bei der therapeutischen Reaktion von IDO-Gal3 spielt. In Übereinstimmung damit zeigt unsere frühere Arbeit20,23,24,25, dass die Fusion von Proteinen an den N-Terminus von Gal3, wie NanoLuc, GFP oder Galectin-1, die Signalaktivität von Gal3 ausschaltet, wahrscheinlich aufgrund seiner Fähigkeit, höhergeordnete Strukturen zu bilden Oligomeren wird gehemmt, während die Glykan-Bindungsaffinität aufrechterhalten bleibt.

Angesichts der Fähigkeit der endogenen zellulären IDO-Genexpression (Ido1), als positives Feedback zur weiteren Steigerung der Expression zu dienen9, wurden endogene Ido1-Transkripte nach der Behandlung mit IDO-Gal3 sowohl im LPS- als auch im Psoriasis-Modell quantifiziert (ergänzende Abbildung 5). Während sowohl die LPS- als auch die Imiquimod-Provokation die endogene Ido1-Expression als erwartete Reaktion auf eine Entzündung induzierten, war dies interessanterweise bei den provozierten, mit IDO-Gal3 behandelten Geweben nicht der Fall, und die Werte waren mit dem Ausgangswert vergleichbar. Diese Daten legen nahe, dass die exogene Zufuhr von IDO-Gal3 die Entzündungssignalisierung und die damit verbundene Induktion der endogenen Ido1-Expression in lokalen Geweben blockierte; Allerdings könnte eine geringe endogene IDO-Expression, die durch IDO-Gal3 in bestimmten Zelluntergruppen (z. B. dendritische Zellen entweder lokal oder im Lymphgewebe) induziert wird, möglicherweise auch zur Auflösung der Entzündung beitragen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die sc-Verabreichung von IDO-Gal3 Hautentzündungen sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch linderte, indem zwei verschiedene Entzündungsschübe über verschiedene spezifische Rezeptoren (CD14/TLR4 für LPS und TLR7 für Imiquimod) eingesetzt wurden26.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Gal3-Fusion mit verschiedenen Enzymen eine Glykan-Bindungsaffinität verleiht, die die Enzymdiffusion in Geweben einschränkt, die Retention verlängert und die enzymatische Katalyse lokalisiert20. In-vivo-Bildgebung konnte bis zu 14 Tage lang Fluorophor-markiertes IDO-Gal3 an der Injektionsstelle des sc-Sprunggelenks nachweisen (ergänzende Abbildung 6a). Erhöhte Kynureninspiegel im umgebenden Gewebe, die durch Massenspektrometrieanalyse festgestellt wurden, stimmten mit der enzymatischen In-vivo-IDO-Funktion überein (ergänzende Abbildung 6b). Darüber hinaus zeigte die Biolumineszenzbildgebung des verankerten Reporterenzyms, der Fusion von NanoLuc-Luciferase und Gal3 (NL-Gal3), dass es im Vergleich zu nicht verankertem NanoLuc in hohen Mengen zurückgehalten wurde, und deutete darauf hin, dass in das Sprunggelenk injiziertes NL-Gal3 sc weitgehend auf die Injektion beschränkt war Allerdings wurde auch in der angrenzenden Tibiaregion, im Plasma und in den Ausscheidungswegen von Urin und Kot eine geringere Enzymaktivität festgestellt (ergänzende Abbildung 7). Um festzustellen, ob lokalisiertes IDO-Gal3 eine systemische Immunsuppression induzierte (ergänzende Abbildung 6c – k), wurden Mäuse 120 Stunden nach der Injektion einer LPS-Exposition an ipsilateralen und kontralateralen Stellen und separat einer oralen Infektion mit Listeria monocytogenes ausgesetzt. Die prophylaktische Verabreichung von IDO-Gal3 im ipsilateralen Sprunggelenk blockierte die LPS-induzierte Entzündungszellinfiltration sogar 120 Stunden nach der Vorbehandlung, wohingegen das Infiltrat an der kontralateralen LPS-Expositionsstelle erhöht war, was darauf hindeutet, dass die Entzündungsblockade an der ipsilateralen Stelle lokalisiert war (ergänzende Abb. 6c,d). Die Verabreichung von IDO-Gal3 in das Sprunggelenk veränderte die Clearance von L. monocytogenes in Leber oder Milz im Vergleich zur Vehikelkontrolle nicht (ergänzende Abbildung 6e – g), was auf die Aufrechterhaltung eines global funktionierenden Immunsystems bei gleichzeitiger gewebelokaler Unterdrückung hinweist . Als Bestätigung für die anhaltende Verringerung der zellulären Infiltrationsdaten 120 Stunden nach der Vorbehandlung mit IDO-Gal3 (ergänzende Abbildung 6c, d) wurde die Expression von IL-6 und IL-1β an der ipsilateralen LPS-Expositionsstelle (ergänzende Abbildung 6h, i) wurde unterdrückt; Die Expression von IL-12p35, IL-12p40 und IFN-γ (ergänzende Abbildung 8) wurde ebenfalls unterdrückt, wodurch ein Anstieg des Plasma-IL-6-Proteins verhindert wurde (ergänzende Abbildung 6j) und die Grundlinien-Plasma-IL-1β-Spiegel aufrechterhalten wurden (ergänzende Abbildung 6k). im Serum durch Massenspektrometrie nachgewiesen. Zusammengenommen legen diese Beobachtungen nahe, dass im Gewebe verankertes IDO-Gal3 eine starke lokale Unterdrückung der Entzündung induzierte, ohne die Immunfunktion global zu unterdrücken.

Parodontitis ist eine Klasse nicht heilender chronisch entzündlicher Erkrankungen, die aus einer lokalisierten Schleimhautentzündung und Osteoklastenaktivierung resultieren und zur Zerstörung von weichem (Schleimhaut) und hartem (Knochen) Gewebe führen27. Die submandibuläre Injektion von IDO-Gal3 wurde anhand eines prophylaktischen und therapeutischen Verabreichungsschemas in einem Mausmodell für polymikrobielle Parodontitis28,29 (Abb. 2a,b) lokal erhalten, unterdrückte Schleimhautentzündungen und verschonte den Alveolarknochenverlust (Abb. 2c–l). ). In-vivo-Bildgebung des verankerten Reporters NL-Gal3 zeigte eine Zahnfleischretention für 120 Stunden (Abb. 2c, d), wohingegen die Gewebelokalisierung für das nicht verankerte NL nach 36 Stunden nicht gemessen werden konnte (Abb. 2d). Die Retentionszeit änderte sich weder in Gegenwart noch in Abwesenheit einer polymikrobiellen Infektion (Abb. 2e). Das primäre Ergebnis einer Parodontitis, der Verlust von Unterkieferknochen, wurde durch Mikrocomputertomographie (Mikro-CT)-Analyse quantifiziert. Bei prophylaktischer Verabreichung (IDO-Gal3-P) verhinderte die submandibuläre Injektion den Knochenverlust und bei therapeutischer Verabreichung hemmte IDO-Gal3 den weiteren Knochenverlust (IDO-Gal3-T; Abb. 2f). Insbesondere der Verlust des trabekulären Knochenvolumens (Abb. 2g) und der Dicke (ergänzende Abb. 9) sowie der vertikale Knochenverlust (Abb. 2h) wurden entweder durch die prophylaktische oder therapeutische Verabreichung von IDO-Gal3 verhindert. IDO-Gal3 hemmte auch Zahnfleischentzündungen, gemessen anhand der Proteinspiegel der Zytokine IL-6 (Abb. 2i) und IL-1β (Abb. 2j) sowie des Chemokins MCP1 (Abb. 2k). Im Gegensatz dazu wurde die IL-10-Produktion durch die IDO-Gal3-Behandlung weitgehend aufrechterhalten (Abb. 2l), wobei die Werte näher an denen von nicht infizierten Mäusen lagen, was auf eine Rückkehr zur homöostatischen Kontrolle hindeutet. Bei der therapeutischen Verabreichung von IDO-Gal3 wurde im Vergleich zur prophylaktischen Verabreichung (Abb. 2h–k), bei der die entzündlichen Zytokine IL-12p70, IP-10, KC-17 und MIP vorhanden waren, eine stärkere Verringerung des Knochenverlusts und eine stärkere Unterdrückung der Entzündung beobachtet -2 und IL-33 waren am stärksten betroffen (ergänzende Abbildung 10). IDO-Gal3, das nicht infizierten Mäusen verabreicht wurde (IDO-Gal3-U), hatte eine vernachlässigbare Wirkung auf den Unterkieferknochen und die Produktion von entzündlichen Zytokinen; Es wurden jedoch erhöhte IL-10- und in geringerem Maße MCP1-Spiegel beobachtet (Abb. 2j – l). Darüber hinaus hatte die Verabreichung von IDO-Gal3 keinen Einfluss auf die Menge an Porphoromonas gingivalis oder Aggregatibacter actinomycetemcomitans, die aus der Gingiva gewonnen wurden, unabhängig vom prophylaktischen oder therapeutischen Verabreichungsschema (ergänzende Abbildung 11). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass IDO-Gal3 die klinisch-therapeutischen Anforderungen für die Behandlung parodontaler Erkrankungen erfüllt: lokalisierte Regulierung von Entzündungen ohne verstärkte Bakterienansammlung und Verhinderung eines anhaltenden Knochenverlusts im Unterkiefer, selbst nach Beginn der Krankheitsprogression.

a,b: Die Wirksamkeit wurde anhand eines polymikrobiellen Mausmodells für Parodontitis und entweder prophylaktischer (a) oder therapeutischer (b) Verabreichung untersucht. c,d: Das verankerte Fusionsreporterenzym NanoLuc-Gal3 (NL-Gal3), das submandibulär injiziert wurde, wurde laut In-vivo-Bildgebung 120 Stunden lang lokal zurückgehalten (c), im Gegensatz zu nicht verankertem NanoLuc, das von der Injektionsstelle weg diffundierte (d, gestrichelt). Die Linie stellt die Grundlinie dar). e, der Infektionszustand hatte keinen Einfluss auf die submandibuläre Retentionszeit von NL-Gal3; Die gepunktete Linie stellt die Grundlinie dar. f–h, Repräsentative Bilder einer Mikro-CT-Analyse (f) zur Quantifizierung des trabekulären Knochenvolumens (g) und des vertikalen Knochenverlusts (h) durch Messung der Zement-Schmelz-Grenze. In f: Maßstabsbalken, 1,5 mm; Das gelbe Kästchen stellt den standardisierten ROI von 5,5 mm3 dar, basierend auf 1,5 × 4,0 × 1,0 mm (vertikal oder zerviko-apikal × horizontal oder mesio-distal × lateral oder bukkal-palatinal); Die orangefarbenen Linien zeigen die gemessenen Abstände zwischen dem CEJ und dem Alveolarknochenkamm (n = 12). Die submandibuläre Injektion von IDO-Gal3 blockierte den Unterkieferknochenverlust bei der prophylaktischen (IDO-Gal3-P) Verabreichung und stoppte den Unterkieferknochenverlust bei der therapeutischen (IDO-Gal3-T) Verabreichung. i–k, IDO-Gal3 reduzierte die gingivalen Entzündungsproteinspiegel von IL-6 (i), IL-1β (j) und MCP1 (k), mit einer ausgeprägteren Wirkung durch die therapeutische Verabreichung (IDO-Gal3-T). l, IDO-Gal3 induzierte die Expression des IL-10-Proteins und stellte Werte wieder her, die näher an denen der nicht infizierten Kontrolle (Uninfect) lagen. IDO-Gal3, das nicht infizierten Mäusen verabreicht wurde (IDO-Gal3-U), hatte eine vernachlässigbare Wirkung auf den Unterkieferknochen und die Produktion von entzündlichen Zytokinen, während die IL-10- und in geringerem Maße MCP1-Spiegel anstiegen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (d und e) und Mittelwert ± Standardabweichung (g–l) angezeigt. Statistische Analyse: (e) Student-T-Test; n = 5; (g–l) einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test, n = 5. Für (g), P < 0,0001, F = 20,41. Für h gilt P < 0,0001, F = 75,53. Für i gilt P < 0,0001, F = 73,69. Für j, P < 0,0001, F = 44,24. Für k, P < 0,0001, F = 66,63. Für l gilt P < 0,0001, F = 122,8. Für g–l werden, sofern nicht anders angegeben, paarweise P-Werte aus Tukeys Post-hoc-Analyse als „X, Y“ angegeben, wobei X den Vergleich mit „Infect“ und Y den Vergleich mit „Uninfect“ darstellt; ****P < 0,0001.

Die posttraumatische entzündliche Arthrose (PTOA), eine Form der Arthrose (OA), entsteht häufig nach einem Bänder- oder Meniskusriss oder nach wiederholter Überlastung eines Gelenks. Ein PTOA-Mausmodell mit zyklischer mechanischer Überlastung30,31 wurde verwendet, um die Fähigkeit von IDO-Gal3 zu testen, belastungsbedingte entzündliche Gelenkschäden zu reduzieren. Die intraartikuläre Injektion von IDO-Gal3 blieb lokal erhalten, unterdrückte Entzündungen und verschonte die Zerstörung des Gelenkgewebes (Abb. 3). Auf die Knie gealterter Mäuse wurde eine zyklische mechanische Belastung ausgeübt (Abb. 3a und ergänzende Abb. 12), wobei mechanische Schäden und daraus resultierende Entzündungen zu Synovialentzündungen und Knorpelabbau führten. In einer Retentionsstudie wurde fluoreszierend markiertes IDO oder markiertes IDO-Gal3 nach 2 Wochen anfänglicher mechanischer Belastung des Gelenks verabreicht. Die Bildgebung 24 Stunden (ergänzende Abbildung 13) und Tag 7 nach der Injektion ergab, dass die Retention von markiertem IDO-Gal3 im Gelenk signifikant höher war als bei nicht verankertem IDO, sichtbar in explantierten Knien (Abb. 3b) und quantifiziert (Abb. 3c). durch Ex-vivo-Bildanalyse. Die pharmakokinetische Fläche unter der Kurve (AUC), berechnet aus der täglichen intravitalen Bildgebung über 7 Tage, war für IDO-Gal3 etwa doppelt so hoch wie für IDO allein (Abb. 3d). Die wöchentliche intraartikuläre Verabreichung von IDO-Gal3 blockierte die Genexpression der entzündlichen Zytokine IL-6 und IL-12p40 im kombinierten Gelenkgewebe (Synovialwand und Gelenkoberfläche; Abb. 3e, f) und entwässernden Lymphknoten (Abb. 3g, h). , wohingegen IDO allein dies nicht tat. Im Gegensatz dazu wurde die Expression von weder MMP13 noch TNF-α an beiden Stellen moduliert (ergänzende Abbildung 14). Entscheidend ist, dass IDO-Gal3 belastungsbedingte histologische Veränderungen reduzierte, wie von einem behandlungsblinden Histopathologen sowohl anhand des Gesamt-Gesundheitsscores der Gelenke (DJD-Score (Degenerative Joint Disease)) (Abb. 3i, j) als auch des Gelenkknorpel-Scores (OARSI) bewertet wurde ( Abb. 3k,l). Zusätzliche histologische Proben stützen diese Trends (Ergänzende Abbildungen 15–18; Beschreibung der Bewertungskriterien in den ergänzenden Abbildungen 19 und 20). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Gal3-Fusion für eine lokale Gelenkretention sorgte und IDO-Gal3 die entzündliche Genexpression und die durch mechanische Überlastung verursachten strukturellen Veränderungen im Gelenk wirksam reduzierte.

a: Ein 4-wöchiges PTOA-Mausmodell mit zyklischer mechanischer Überlastung wurde bei Mäusen verwendet, die wöchentlich mit intraartikulären IDO-Gal3-Injektionen behandelt wurden. b,c: Fluoreszenzbildgebung des Knieexplantats zur Veranschaulichung (b) und Quantifizierung (c) der Retention von fluoreszierend markiertem IDO und IDO-Gal3 am 7. Tag, verabreicht nach 2 Wochen mechanischer Belastung. d, pharmakokinetische AUC-Analyse aus der täglichen Fluoreszenzbildgebung über 7 Tage. e–h, Die Genexpression der Zytokine IL-6 und IL-12p40 wurde durch quantitative PCR im kombinierten Gelenkgewebe der Synovialwand und der Gelenkoberfläche (e,f) sowie in dränierenden Lymphknoten (g,h) gemessen. i,j, H&E-gefärbte Gelenkhistologie an Knien, die eine synoviale Entzündung und Verdickung hervorhebt (i) und DJD-Bewertung des Fortschreitens der Gelenkerkrankung (j). k,l, histologische Safranin-O-Färbung, die Strukturveränderungen und Proteoglykangehalt des Gelenkknorpels hervorhebt (k) und OARSI-Bewertung der Knorpelstruktur (l). Daten in j und l werden als Mittelwert ± 95 % KI dargestellt. Statistische Analyse: (c,d) Student-t-Test, n = 6. Für e–h: einfache ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test; n = 6. Für e gilt P = 0,0035, F = 6,303. Für f gilt P < 0,0001, F = 12,92, ****P < 0,0001. Für g ist P = 0,0128, F = 4,639. Für h ist P = 0,0069, F = 5,403. Für j und l: Brown-Forsythe- und Welch-ANOVA; n = 6. Für j gilt P = 0,0325, F* = 4,173. Für l ist P = 0,0012, F* = 6,083. Für statistisch unterschiedliche Gruppen angegebene P-Werte; alle anderen Gruppen, NS.

Wir stellen fest, dass mehrfache Injektionen von menschlichem IDO-Gal3 in Mäuse zum Auftreten einiger Anti-IDO-Gal3-Antikörper führten (ergänzende Abbildung 21), was angesichts der Fehlpaarung des Wirts nicht unvernünftig ist. Allerdings traten diese Antikörper erst nach etwa drei Injektionen auf und verringerten die Wirksamkeit in Modellen mit mehreren Injektionen (Arthrose und Parodontitis) im Vergleich zu Modellen mit Einzelinjektionen (LPS-Entzündung und Psoriasis) nicht.

Schmerzen und Behinderungen bei Arthrose gehen mit einer chronischen Entzündung in einem irreparabel geschädigten Gelenk ein32. Um eine Einzeldosis-IDO-Gal3-Behandlung bei bestehender Arthrose zu untersuchen, wurde ein chirurgisch induziertes PTOA-Rattenmodell verwendet, bei dem sich Arthrose über einen Zeitraum von 8 Wochen nach der Durchtrennung des medialen Kollateralbandes und des medialen Meniskus (MCLT + MMT) zu einer aufgelaufenen Gelenkschädigung entwickelte33, 34. Die intraartikuläre Injektion von IDO-Gal3 blieb lokal erhalten, unterdrückte Gelenkentzündungen, reduzierte OA-assoziierte Schmerzen und verbesserte den Gang der Ratten (Abb. 4). Bei Verabreichung sowohl in OA- als auch in kontralaterale gesunde Gelenke (Abb. 4a) war die Lumineszenz des NL-Gal3-verankerten Reporters über mehrere Tage nach der Injektion messbar, während nicht verankertes NL nach 1 Tag im Gelenk nicht mehr gefunden wurde (Abb. 4c). Die gemeinsamen Verweilzeiten (95 % Zerfall) für NL-Gal3 betrugen 2 Tage in OA-Gelenken und 1,3 Tage in gesunden Gelenken, was bis zu viermal länger ist als 0,5 Tage für NL sowohl in OA-Gelenken als auch in gesunden Gelenken (Abb. 4c rechts). ). Die Injektion von IDO-Gal3 8 Wochen nach der Operation (Abb. 4b) blockierte die lokale entzündliche Zytokinproduktion und kehrte darüber hinaus die OA-assoziierte taktile Empfindlichkeit und den kompensatorischen Gang um (Abb. 4d–g). Die Behandlung mit IDO-Gal3 reduzierte die Proteinproduktion des entzündlichen Zytokins IL-6 in OA-Gelenken auf Werte, die in gesunden Gelenken zu finden sind (Abb. 4d). Darüber hinaus folgten die lokalen Konzentrationen des entzündlichen Chemokins MCP1 demselben Trend (P = 0,09; Abb. 4e). Die taktile Empfindlichkeit als Maß für OA-assoziierte Schmerzen wurde über 3 Wochen unter Verwendung von von Frey-Monofilamenten quantifiziert (ergänzende Abbildung 22, absolute Werte). Aufgetragen als Änderung der Pfotenrückzugsschwelle (nach der Injektion − vor der Injektion) kehrte die Behandlung mit IDO-Gal3 die Überempfindlichkeit der Gliedmaßen am 8. Tag nach der Injektion um und hielt bis zum 23. Tag an, was einer zweifachen Verbesserung entspricht, während die Injektion mit Kochsalzlösung als Vehikel bewirkte nur geringfügige Verbesserung (Abb. 4f). Der Gang der Nagetiere wurde durch gleichzeitige Hochgeschwindigkeitsvideoaufnahmen und Kraftmessplattenaufzeichnungen bewertet35. Mit IDO-Gal3 behandelte Ratten liefen am 16. Tag nach der Injektion schneller und neigten am 23. Tag nach der Injektion dazu, schneller zu gehen (ergänzende Abbildung 23a, b). Bemerkenswerterweise zeigte die als Funktion der Geschwindigkeit aufgezeichnete maximale vertikale Kraft, dass eine einzelne IDO-Gal3-Injektion die unausgewogene Gewichtsverteilung bei OA-betroffenen Tieren korrigierte, bei denen die dynamische Belastung der mit IDO-Gal3 behandelten Gliedmaßen während der gesamten Studie nicht von der der gesunden kontralateralen Kontrollen zu unterscheiden war Dauer (Abb. 4g obere Reihe und ergänzende Abb. 23c). Dies stand im Gegensatz zu dem deutlichen Belastungsungleichgewicht zwischen mit Kochsalzlösung behandelten und kontralateralen Gliedmaßen (Abb. 4g, untere Reihe und ergänzende Abb. 23c). Bemerkenswerterweise unterschieden sich die Behandlungen mit IDO-Gal3 und Kochsalzlösung an den Tagen 9, 16 und 24 nach der Injektion erheblich. Insgesamt deuten diese Daten auf eine starke Linderung der bestehenden OA-Entzündung und eine damit einhergehende Verbesserung der OA-Symptome hin.

a: Nach einem chirurgisch simulierten Meniskusriss bei der Ratte wurde die Clearance von NL-Gal3 8 Wochen nach der aufgetretenen Gelenkschädigung beurteilt. b: Unter Verwendung des gleichen Modells und Versuchsdesigns wurden die Auswirkungen von IDO-Gal3 auf OA-assoziierte Entzündungen und Symptome bewertet. c, Lumineszenzbildgebung (links) zeigte, dass NL-Gal3 sowohl in OA-betroffenen als auch in gesunden Gelenken länger erhalten bleibt als unkonjugiertes NL, mit deutlich längeren Zeiten bis zum 95-prozentigen Zerfall (rechts) in NL-Gal3-injizierten Knien. d, 28 Tage nach der Injektion in von Arthrose betroffene Gelenke wiesen die mit Kochsalzlösung behandelten Knie einen erhöhten IL-6-Spiegel auf (P = 0,0021, t = 3,4689, df = 23,3), während die IDO-Gal3-Spiegel mit denen gesunder kontralateraler Knie vergleichbar waren. e: Die intraartikulären Konzentrationen von MCP1 (d. h. CCL2) folgten einem ähnlichen Profil, aber CCL2 war in dieser Studie in mit Kochsalzlösung behandelten Knien nicht signifikant erhöht (P = 0,09, F = 3,41, (df, df) = (1). , 24)). f: Im Vergleich zu mit Kochsalzlösung behandelten Tieren zeigten mit IDO-Gal3 behandelte Tiere im Laufe der Zeit eine Verbesserung der taktilen Empfindlichkeit. Die Rohdaten sind in der ergänzenden Abbildung 22 dargestellt. g: IDO-Gal3-behandelte Tiere hatten eine ähnliche Gewichtsverteilung zwischen ihren von Arthrose betroffenen und kontralateralen Gliedmaßen, während mit Kochsalzlösung behandelte Tiere eine signifikante Entlastung der von Arthrose betroffenen Gliedmaßen aufwiesen. Rohdaten sind in der ergänzenden Abbildung 23 dargestellt. n = 6 für OA-Vehikel und gesunde Kontrolle in d und e; n = 7 für OA-IDO-G3 und seine gesunde Kontrolle in d und e; n = 7 für f. In d–f werden die Daten als Mittelwert ± 95 % KI dargestellt. Die Daten in d und e wurden mit einem linearen Mixed-Effects-Modell analysiert, wobei Gliedmaßen und Behandlungsgruppe als feste Faktoren und Tier als zufälliger Effekt behandelt wurden. Wenn dies durch eine ANOVA zu den festen Effekten angezeigt wird, wurden mehrere Vergleiche der Schätzungen der kleinsten quadratischen Mittel mithilfe einer Tukey-HSD-Korrektur um zusammengesetzte Fehler vom Typ 1 korrigiert. Die Daten in f wurden mit einer ANOVA mit wiederholten Messungen mit Post-hoc-Tukey-HSD-Anpassung für zusammengesetzte Typ-1-Fehler analysiert. In f: *P = 0,0244, F = 6,8883, (df, df) = (1, 11). Spezifische Unterschiede zwischen IDO-G3-behandelten und Vehikel-behandelten Knien in jeder Woche sind wie folgt: Woche 9: P = 0,013, t = 2,61, df = 41; Woche 10: P = 0,004, t = 3,07, df = 41; und Woche 11: P = 0,041, t = 2,11, df = 41. In g: Fehlerbänder repräsentieren 95 % KI des Populationsmittelwerts; Verhaltensdaten wurden mithilfe eines linearen Mixed-Effects-Modells ausgewertet, bei dem Tieridentifikatoren als zufälliger Effekt über die Zeit hinweg behandelt wurden. In der g-Spalte 2 unterschied sich die mit Vehikel behandelte Substanz von der kontralateralen Kontrolle (P = 0,002, t = 3,099, df = 774) und die mit IDO-G3 behandelte Substanz unterschied sich von der mit Vehikel behandelten Substanz (P = 0,007, t = 2,73, df = 260). ; in Spalte 3 unterschieden sich die mit IDO-G3 behandelten von den mit Vehikel behandelten (P = 0,008, t = 2,72, df = 131); und in Spalte 4 unterschied sich die mit Vehikel behandelte Substanz von der kontralateralen Kontrolle (P = 0,004, t = 2,88, df = 773) und die mit IDO-G3 behandelte Substanz unterschied sich von der mit Vehikel behandelten Substanz (P = 0,016, t = 2,42, df = 225). .

Zusammenfassend stellt die gewebeverankerte Enzymfusion IDO-Gal3 eine neue Klasse entzündungshemmender Proteintherapeutika mit weitreichenden potenziellen Auswirkungen auf bessere Behandlungsergebnisse und reduzierte systemische Nebenwirkungen bei einer Vielzahl lokalisierter entzündlicher Erkrankungen dar. Das zytosolische immunmodulatorische Enzym IDO wurde als exogen wirkendes und lokal verfügbares Proteintherapeutikum konzipiert, um den Metabolismus der essentiellen Aminosäure Tryptophan direkt zu manipulieren und hier als systemisch verfügbares Prodrug zu wirken. Die Fusion mit Gal3 verlängerte die Enzymlokalisierung und -retention durch Bindung an Glykane, die überall in Säugetiergeweben exprimiert werden. Die artenübergreifende Konservierung von Glykanen ermöglicht die Translation, ohne dass eine Neugestaltung für menschenspezifische Ziele erforderlich ist. Durch die Verabreichung von IDO-Gal3 konnte die lokale Entzündung über vier verschiedene Entzündungsherde bei mehreren Arten und in mehreren Gewebeumgebungen wirksam kontrolliert werden. Die Behandlung stellte die Homöostase wieder her, bewahrte die Gewebeintegrität und -funktion und linderte entzündungsbedingte Schmerzen. Die Verabreichung von IDO-Gal3 blockierte in jedem untersuchten Entzündungsmodell gleichmäßig IL-6 sowie zahlreiche andere Zytokine und Chemokine und induzierte keine systemische Immunsuppression. Insgesamt zeigt diese Arbeit, wie das Galectin-verankerte Enzym das Hindernis für die Medikamentenabgabe durch die Diffusion eines Therapeutikums vom beabsichtigten Wirkungsort weg überwindet, und weist auf IDO-Gal3 als entzündungshemmendes Medikament hin.

NanoLuc ist der Handelsname einer von der Promega Corporation36 entwickelten Variante der Luciferase aus Tiefseegarnelen. Gene, die Fusionsproteine ​​kodieren, wurden in pET-21d(+)-Vektoren zwischen NcoI- und XhoI-Stellen eingefügt. Die genetischen und Proteinsequenzen von IDO-Gal3 finden Sie in den Zusatzinformationen. Plasmide verleihen Ampicillin-Resistenz und wurden zunächst in chemisch kompetente One Shot TOP10 E. coli (ThermoFisher) transformiert, auf Luria-Bertani (LB)-Ampicillin-Agar (50 μg ml−1) selektiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Von den Platten isolierte Kolonien wurden in 5 ml LB-Ampicillin-Brühe über Nacht bei 37 °C unter orbitalem Schütteln subkultiviert. Erfolgreiche Transformanten wurden durch Sanger-Sequenzierung (Genewiz) bestätigt. Positive DNA-Sequenzen wurden dann in den Kanamycin B-resistenten Expressionsstamm Origami B (DE3) E. coli (Novagen) transformiert und auf LB-Ampicillin mit Kanamycin B-Agar (15 μg ml–1) selektiert. Positive Klone wurden ausgewählt, in LB mit 10 % w/v Glycerin gelagert und zur Vorkultur von 5 ml LB-Ampicillin und Kanamycin verwendet. Vorkulturen über Nacht wurden verwendet, um 1 l 2× TY-Medium (16 g Trypton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl) mit Ampicillin und Kanamycin B bei 37 °C und 225 U/min in einem Orbitalschüttler zu beimpfen, bis eine ungefähre exponentielle Wachstumsphase (optische Dichte ( OD)600 nm = 0,6–0,8). IDO-Gal3-Expressionskulturen wurden zum Zeitpunkt der Inokulation mit 500 μM δ-Aminolävulinsäure (Sigma) ergänzt. Die rekombinante Proteinexpression wurde mit 0,5 mM Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (ThermoFisher) ausgelöst und 18 Stunden lang in einem Orbitalschüttler bei 18 °C inkubiert. Die Bakterien wurden gewaschen und mit PBS durch Zentrifugation (13.180 × g bei 4 ° C für 10 Minuten) mit einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge (ThermoFisher) pelletiert. Anschließend wurde das Pellet gewogen, in 4 ml PBS pro Gramm Pellet mit Proteaseinhibitor (ThermoFisher) resuspendiert und durch Schallzerlegung (15 s an, 45 s aus, 10 min Zykluszeit; ThermoFisher) aufgebrochen. Nach der Zerlegung wurden die Lysate mit 20 Einheiten pro Gramm Pellet-DNAse I (ThermoFisher) und 800 μg g-1 Pellet-Lysozym (ThermoFisher) behandelt. Das Lysat wurde zentrifugiert (38.360 × g bei 4 °C für 15 Minuten), um die unlösliche Fraktion zu entfernen, und der Überstand wurde durch Dekantieren gesammelt. Der Überstand, der lösliches rekombinantes Protein enthielt, wurde in eine mit PBS voräquilibrierte α-Lactose-Agarose-(Sigma)-Affinitätssäule geladen. Die Säulen wurden mit 20 Säulenvolumina PBS gewaschen und rekombinante Proteine ​​wurden mit 100 mM β-d-Lactose (Sigma), hergestellt in PBS, eluiert. Ein letzter Polierschritt wurde durch 200-kDa-Größenausschlusschromatographie auf dem reinen AKTA-Chromatographiesystem (GE Life Sciences) durchgeführt, um α-Laktose zu entfernen und IDO-Gal3 weiter zu isolieren. Die Proteinreinheit wurde durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Coomassie-Färbung bestimmt. Endotoxin-Verunreinigungen wurden mit einer Endotoxin-Entfernungslösung (Sigma) gemäß den Anweisungen des Herstellers entfernt. Der Endotoxingehalt wurde mithilfe des kinetischen chromogenen Endotoxin-Quantifizierungstests Chromo-LAL (Associates of Cape Cod) analysiert und es wurde festgestellt, dass er in allen Beständen unter 0,1 EU ml−1 lag.

In E. coli exprimiertes rekombinantes menschliches IDO wurde von R&D Systems erworben (vorhergesagte Molekularmasse 46 kDa, eine spezifische Aktivität von >500 pmol min−1 μg−1 (oder für äquimolare Berechnungen >29 pmol NFK min−1 pmol−1 IDO). ), gemessen an seiner Fähigkeit, L-Tryptophan zu N-Formyl-Kynurenin (NFK) zu oxidieren. Die spezifische Aktivität beider Proteine, IDO und IDO-Gal3, wurde vor den Experimenten gemessen, um eine maximale Wirkung zu Beginn des Tests gemäß dem Protokoll des IDO-Herstellers sicherzustellen. IDO-Gal3 wurde im Standardprotokoll in äquimolaren Mengen zu IDO umgesetzt und die Aktivitäten wurden unter Verwendung der Einheit pmol NFK min−1 pmol−1 IDO verglichen, um die Aktivität genauer vergleichen zu können.

Die Affinität von IDO-Gal3 für Laktose wurde mithilfe der Affinitätschromatographie in einem AKTA Pure-Chromatographiesystem (GE Life Sciences) bestimmt, das mit einer für den Verbraucher verpackbaren Glassäule (GE Life Sciences) ausgestattet war, die mit α-Laktose-Agarose-Affinitätsharz (Sigma-Aldrich) gefüllt war. Proteine ​​wurden mit einem linearen Gradienten von β-Lactose (Sigma-Aldrich) in Phosphatpuffer eluiert.

Die verwendete Sequenz war , wobei die Restriktionsstellen unterstrichen waren.

MAHAMENSWTISKEYHIDEEVGFALPNPQENLPDFYNDWMFIAKHLPDLIESGQLRERVEKLNMLSIDHLTDHKSQRLARLVLGCITMAYVWGKGHGDVRKVLPRNIAVPYCQLSKKLELPPILVYADCVLANWKKKDPNKPLTYENMDVLFSFRDGDCSKGFFLVSLLVEIAAASAIKVIPTVFKAMQMQERDTLLKALLEIASCLEKALQVFHQIHDHVNPKAFFSVLRIYLSGWKGNPQLSDGLVYEGFWEDPKEFAGGSAGQSSVFQCFDVLLGIQQTAGGGHAAQFLQDMRRYMPPAHRNFLCSLESNPSVREFVLSKGDAGLREAYDACVKALVSLRSYHLQIVTKYILIPASQQPKENKTSEDPSKLEAKGTGGTDLMNFLKTVRSTTEKSLLKEGGSGGGSGGSGGSGGEFADNFSLHDALSGSGNPNPQGWPGAWGNQPAGAGGYPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYPGAPGAYPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSAPGAYPATGPYGAPAGPLIVPYNLPLPGGVVPRMLITILGTVKPNANRIALDFQRGNDVAFHFNPRFNENNRRVIVCNTKLDNNWGREERQSVFPFESGKPFKIQVLVEPDHFKVAVNDAHLLQYNHRVKKLNEISKLGISGDIDLTSASYNMILEHHHHHH

B6-Mäusen wurden 2,1 μg IDO-Gal3 in 40 μl PBS subkutan (ipsilateral und kontralateral) im Bereich des Sprunggelenks verabreicht und mit 2 ng g-1 Lipopolysaccharid (LPS) in 40 μl nach 24 Stunden oder 120 Stunden nach IDO-Gal3 injiziert. Gal3-Behandlung zur Beurteilung der lokalen und distalen Modulation der Entzündung. Zwei Stunden nach der LPS-Verabreichung wurden die Tiere eingeschläfert und die Injektionsstelle entnommen.

Weichgewebe wurde vom Knochen getrennt und zur Vorbereitung der qPCR in RNAlater RNA-Stabilisierungsreagenz (Qiagen) gelagert. Weichgewebe wurden homogenisiert und die RNA mit dem RNeasy Protect Mini-Kit (Qiagen) gereinigt. Komplementäre DNA wurde aus RNA unter Verwendung des High-Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit (ThermoFisher) zur Verwendung in qPCR gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Die qPCR-Analyse wurde mit Primern durchgeführt, die für proinflammatorische Zytokine (IL-12a, IL-12b, IL-1β, IFN-γ und IL-6) spezifisch sind, unter Verwendung des Applied Biosystems QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System. Die Ergebnisse werden als Verhältnis der Genexpression zur Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)-Expression dargestellt, bestimmt durch die relative Quantifizierungsmethode. Die Behandlungsgruppen wurden auf die reine PBS-Gruppe normalisiert.

Die Mäuse wurden in einzeln belüfteten Käfigen mit Maiskolbeneinstreu gehalten, mit Umkehrosmosewasser und Standardnahrung, einem 14-Stunden-10-Stunden-Dunkel-Licht-Zyklus, einer Raumtemperatur von 68–79 ℉ und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 30–70 % ausgestattet.

Die Gewebe wurden über Nacht mit 10 % neutralem Formalin (pH 7,4) fixiert. Nach der Fixierung wurden die Gewebe in entionisiertem Wasser gewaschen und durch dreiwöchige Lagerung in 10 % Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei 4 °C entkalkt. Die Proben wurden alle 2–3 Tage auf Steifheit untersucht und die EDTA-Lösung aufgefüllt. Die Gewebe wurden in 70 %igem Ethanol zur Verarbeitung, Einbettung in Paraffin, Schneiden, Einbetten und Färben mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) an den Molecular Pathology Core der University of Florida geschickt. Gewebe wurden mit einem Zeiss Axiovert 200M mit einer x20-Objektivlinse durch das mehrdimensionale Erfassungsmodul abgebildet. Pro Gewebe wurden elf Bilder aufgenommen und von zwei verblindeten unabhängigen Personen auf der Grundlage der Zellinfiltration (0: nicht vorhanden, 1: leicht, 2: mäßig, 3: schwer) und der Epidermishypertrophie (0: 0–20 μm dick, 1) bewertet : 21–40 μm, 2: 41–60 μm, 3: 61 μm oder mehr).

IDO-Gal3 (2,2 μg) in 40 μl PBS oder 40 μl PBS allein wurde in die Sprunggelenksstelle von B6-Mäusen (n = 3) injiziert. 30 Minuten nach der Injektion wurden die Mäuse eingeschläfert, die Geweberegionen des Sprunggelenks und des Schienbeins herausgeschnitten und unter Verwendung von flüssigem Stickstoff schockgefroren. Diese Proben wurden dann zur massenspektrometrischen Analyse des Kynureninspiegels an das Southeast Center for Integrated Metabolomics der University of Florida geschickt.

An den vorgeschriebenen Endpunkten wurden die Tiere in eine tiefe Endanästhesie versetzt und Herzpunktionen durchgeführt. Blut (2 ml) wurde in Microtainer-Serumseparatorröhrchen gesammelt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1.500 U/min zentrifugiert. Das Serum wurde gesammelt und bei –20 °C gelagert. Die Zytokinanalyse wurde unter Verwendung eines Luminex 200-Systems mit der xPONENT 3.1-Software (Luminex) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

In Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Florida wurde eine präklinische Modellierung der Psoriasis an 8–12 Wochen alten weiblichen C57BL/6j-Mäusen (Jackson Laboratory) durchgeführt. Das verwendete Modell war eine modifizierte Version eines zuvor gemeldeten Modells37. Kurz gesagt, die Mäuse wurden betäubt und ihre Rücken rasiert, gefolgt von der Anwendung einer Enthaarungscreme, um jegliches verbleibende Fell zu entfernen. Insgesamt 14 Tage lang wurde jeden Tag 5 % IMQ-Creme (62,5 mg, Patterson Veterinary Supply, 07-893-7787) auf den Rücken der Mäuse aufgetragen. Am dritten Tag der IMQ-Anwendung wurden den Mäusen fünf 10-μg-Dosen IDO-Gal3 in steriler Kochsalzlösung, die gleichmäßig über den Rücken verteilt waren, ein molares Äquivalent von NL-Gal3 im gleichen Volumen oder eine sterile Kochsalzlösung als Kontrolle (Nr = 12 pro Gruppe). Der Schweregrad der Erkrankung wurde jeden Tag anhand einer modifizierten Version des Psoriasis Area and Severity Index (PASI) gemessen, bei der der Wirkungsbereich nicht berücksichtigt wird. Erythem (Rötung), Schuppung und Verdickung wurden unabhängig voneinander bewertet und auf einer Skala von 0 bis 4: 0, keine, 1: leicht, 2: mäßig, 3: deutlich, 4: sehr ausgeprägt, bewertet. Der kumulative Score wurde als Maß für die Schwere der Entzündung angegeben (Skala 0–12).

Die In-vivo-Bildgebung von fluoreszenzmarkiertem IDO-Gal3 wurde in Übereinstimmung mit dem IACUC der University of Florida an 8–12 Wochen alten weiblichen C57BL/6j-Mäusen (Jackson Laboratory) durchgeführt. Vor der Injektion wurde IDO-Gal3 mit IRDye 680RD NHS Ester (LI-COR, 929-70050) gemäß den Anweisungen des Herstellers inkubiert. Mäuse erhielten eine subkutane Injektion von 40 μl (2,1 μg, 3,27 μM) fluoreszierend markiertem IDO-Gal3 in das Sprunggelenk. Unmittelbar nach der Injektion und alle weiteren 24 Stunden nach der Injektion wurden Mäuse mit einem IVIS Spectrum-In-vivo-Bildgebungssystem (PerkinElmer) abgebildet. Fluoreszenzbilder wurden mit dem AF680-Emissionsfilter, einer Motivgröße von 1,5 cm, einer Belichtungszeit von 0,2 s, einem Sichtfeld B (6,6 cm), einer mittleren Binning-Auflösung (Faktor 8) und einer 1F/Stop-Blende aufgenommen. Die relativen Fluoreszenzintensitäten wurden durch eine Pseudofarbskala dargestellt, die von Rot (am wenigsten intensiv) bis Gelb (am intensivsten) reichte.

NanoLuc-Gal3 (164 pmol) in 40 μl PBS wurde subkutan in das Sprunggelenk von B6-Mäusen injiziert. Zu den vorgeschriebenen Zeitpunkten wurden die Tiere gemäß genehmigten Protokollen eingeschläfert. Die interessierenden Organe und Gewebe wurden gesammelt, gewogen, verarbeitet, mit Furimazin inkubiert und die Biolumineszenz mit einem Luminometer quantifiziert. Biolumineszenzbilder wurden mit einem IVIS Spectrum In-vivo-Bildgebungssystem aufgenommen. Die Living Image-Software v4.3.1 (PerkinElmer) wurde verwendet, um die Daten unmittelbar nach der Furimazin-Verabreichung zu erfassen. Die Belichtungszeit für die Biolumineszenzbildgebung betrug 1 s. Die interessierenden Regionen (ROIs) wurden als durchschnittliche Strahlungsdichte (Photonen s−1 cm−2 sr−1) quantifiziert. Die spezifische Proteinmenge im Gewebe wurde durch Vergleich mit einer Standardkurve der NanoLuc-Gal3-Aktivität bestimmt.

Die Immunsuppression durch IDO-Gal3 wurde als Reaktion auf eine orale Infektion mit Listeria monocytogenes InIAM (Stamm 10403s) bewertet. Die Gewebebakterienbelastung in Leber und Milz wurde als Maß für eine Infektion verwendet, wobei die Leber lokal für eine Darminfektion verantwortlich ist und die Milz die systemische Ausbreitung der Infektion darstellt. Am Tag vor der Infektion erhielten 10 Wochen alte naive C57BL/6-Mäuse (Taconic Biosciences) eine IDO-Gal3-Injektion subkutan (Sprunggelenk), während Kontrollmäuse eine sterile Kochsalzlösung-Injektion erhielten. Am folgenden Tag wurden die Mäuse oral mit 2 × 109 koloniebildenden Einheiten (KBE) Listeria monocytogenes pro Maus infiziert. Zur Vorbereitung auf die Infektion wurden die Bakterien über Nacht in BHI-Brühe bei 37 °C und unter Schütteln bei 220 U/min kultiviert. Vor der Infektion wurde eine Subkultur aus 2 ml der Bakterien und 18 ml BHI-Brühe unter den gleichen Bedingungen kultiviert, bis eine OD600 = 0,8 erreicht wurde. Die Bakterien wurden pelletiert, in 500 μl sterilem PBS resuspendiert und 50 μl Bakterien wurden auf ein kleines Quadrat Weißbrot pipettiert und jeder Maus einzeln gefüttert. Sobald das gesamte Stück Brot aufgegessen war, wurden die Mäuse in ihren Käfig zurückgebracht. Am Tag 7 nach der Infektion wurden die Mäuse eingeschläfert, gefolgt von der Entnahme von Milz und Leber. Das Gewebe wurde homogenisiert, 1 Stunde lang in 1 % Saponin suspendiert und dann in Reihenverdünnungen von unverdünnt bis 1:1.000 ausplattiert. BHI-Agarplatten wurden mit Streptomycin behandelt, um unspezifisches Bakterienwachstum zu begrenzen, da dieser Stamm von L. monocytogenes Streptomycin-resistent ist. Die KBE wurden 24 Stunden nach dem Ausplattieren gezählt.

Alle Mäuse wurden 3 Tage lang mit 25 μl 0,12 % Chlorhexidingluconat (3 M) gespült. An den Tagen 4, 5, 6 und 7 erhielten die Mäuse eine 25 μl orale Spülung mit 2,5 × 109 P. gingivalis Stamm 381 und 2,5 × 109 Aggregatibacter actinomycetemocomitans Stamm 29522 (ATCC), resuspendiert in 2 % niedrigviskoser Carboxymethylcellulose ( Sigma-Aldrich). Die orale Spülung wurde 5 Wochen lang jede Woche wiederholt. Jede Woche wurden 1 Tag vor dem ersten Tag der Infektion (prophylaktisch) oder 1 Tag nach dem letzten Tag der Infektion (therapeutisch) 10 μl IDO-Gal3 mit einer 30-Gauge-Insulinspritze (Becton Dickenson) in den Submandibularraum injiziert. . Jede Infektionswoche wurde am ersten Tag der Infektion vor der Infektion eine mikrobielle Probenahme der Mundumgebung mit Calciumalginat-Tupfern (ThermoFisher) durchgeführt. Eine Woche nach der letzten Infektion wurden die Mandibeln gesammelt, um die Expression löslicher Weichgewebemediatoren und die Knochenmorphometrie zu bewerten.

Unterkiefer mit sowohl Weichgewebe als auch Knochen wurden in zwei 2-Minuten-Intervallen mit 2-minütiger Abkühlung dazwischen unter Verwendung von Zirkoniumdioxid-Kügelchen (BioSpec) mit 1,0 mm Durchmesser in Zellextraktionspuffer (ThermoFisher) einem Perlenschlag unterzogen. Der Puffer wurde mit einem Proteaseinhibitor-Cocktail (Mini cOmplete, Roche) und PMSF-Proteaseinhibitor (Abcam) zubereitet, um die Dissoziation und Lyse des gesamten Weichgewebes zu ermöglichen, während das Hartgewebe intakt blieb. MILLIPLEX Multiplex-Assays (EMD Millipore) wurden verwendet, um die resultierenden Lysate gemäß den Herstellerprotokollen auf IL-6, IL-1β, IL-10 und MCP1 zu untersuchen. Die Daten wurden auf einem Luminex 200-System mit der xPONENT 3.1-Software (Luminex) erfasst und mithilfe einer logistischen Spline-Kurven-Anpassungsmethode mit 5 Parametern unter Verwendung der Milliplex Analyst v5.1-Software (Vigene Tech) analysiert. Die Daten werden als pg ml-1 normalisiert auf Gesamtprotein (BCA-Assay; ThermoFisher Pierce) dargestellt.

Die Mandibeln wurden 24 Stunden lang in 4 % gepuffertem Formalin fixiert, in 70 % Alkohol gelagert und mit einem Mikro-CT-System (Skyscan) mit einer Auflösung von 18 μm gescannt. Dreidimensionale Bilder wurden rekonstruiert und die resultierenden Bilder mithilfe anatomischer Orientierungspunkte mit der NRecon- und DataViewer-Software (Skyscan) räumlich neu ausgerichtet. Es wurde ein standardisierter ROI von 5,4 mm3 mit standardisierten Abmessungen von 1,5 (frontal) × 4,0 (sagittal) × 0,9 mm (transversal) festgelegt. Für die standardisierte Positionierung des ROI wurden anatomische Orientierungspunkte verwendet: Frontalebene, das Dach des Furkationsbereichs zwischen mesialen und distalen Wurzeln des oberen ersten Molaren; Sagittalebene, vordere Grenze war der distale Aspekt der mesialen Wurzel des ersten Molaren. Die Dicke des ROI in der Transversalebene wurde auf 50 Schichten (900 μm) eingestellt und in palatinaler/medialer Richtung gezählt, beginnend mit dem Bild, das die Mitte des oberen ersten Molaren in seiner transversalen Breite umfasste. Zur Unterscheidung zwischen nicht mineralisiertem und mineralisiertem Gewebe wurde ein standardisierter Schwellenwert festgelegt, bei dem das Gesamtvolumen und die Gesamtdicke des ROI berechnet wurden. Die Analyse des mittleren trabekulären Knochenvolumens (BV) und der Dicke (BT) ermittelte den Prozentsatz des mineralisierten Gewebes (BV; BT) innerhalb des Gesamtvolumens/der Gesamtdicke (TV; TT) des ROI und wird als BV/TV-Verhältnis (mittleres trabekuläres Knochenvolumen) dargestellt Knochenvolumen) oder BT/TT-Verhältnis (mittlere Trabekeldicke). Der vertikale Knochenverlust ist der Abstand von der Schmelz-Zement-Grenze (CEJ) zum Alveolarknochen und wurde an 12 Stellen über drei Molaren berechnet und gemittelt, um den durchschnittlichen vertikalen Knochenverlust in mm zu berechnen.

Genomische DNA wurde aus mikrobiellen Proben der Mundumgebung mit einem DNeasy-Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Anschließend wurde die gDNA mittels Echtzeit-PCR auf P. gingivalis 16S, A. actinomycetemocomitans 16S und Gesamt-16S untersucht. Der Prozentsatz von A. actinomycetemocomitans 16S und P. gingivalis 16S im gesamten 16S-Kompartiment wurde anhand der folgenden Formel berechnet: Ct-Wert des gesamten 16S/Ct-Wert von A. actinomycetemocomitans oder P. gingivalis 16S. 16s rRNA Für: AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG; Rev: ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT; Seite Für: CTT GAC TTC AGT GGC GGC AG; Rev: AGG GAA GAC GGT TTT CAC CA; Aa Für: GTT TAG CCC TGG CCG AAG; Rev: TGA CGG GCG GTG TGT ACA AGG.

Die IDO-Gal3-Aktivität wurde in einem posttraumatischen Osteoarthritis-Mausmodell30 bewertet, das zyklische mechanische Belastungen auf die Knie von alten (6 Monate) Mäusen ausübt, was zu mechanischen Schäden und daraus resultierenden Entzündungen und Knorpelabbau führt30,31. Die Mäuse wurden betäubt und mit gebeugtem Knie in eine Halterung gebracht; Die Belastung (9 N) wurde axial über 500 Zyklen ausgeübt und die Mäuse wurden während des Experiments fünfmal pro Woche belastet. IDO oder IDO-Gal3 wurden in einer Konzentration von 143 μM zubereitet und 20 μl jeder Behandlung wurden zu Beginn jeder Woche der Studie intraartikulär injiziert, wobei jedes Knie insgesamt 4 Behandlungen erhielt. Am Ende der vierwöchigen Studie wurden die Mäuse zur Analyse der Genexpression und Histopathologie eingeschläfert.

Die Pharmakokinetik der IDO- und IDO-Gal3-Retention nach lokaler Injektion an der Krankheitsstelle wurde durch intravitale Bildgebung über einen Zeitraum von 7 Tagen beurteilt. Beide Proteine ​​wurden mit Li-Cor IRDye 680RD NHS-Ester (Li-Cor Biosciences) markiert, um die Protein-Knieretention sichtbar zu machen und zu messen. Die Mäuse wurden zwei Wochen lang einer mechanischen Belastung ausgesetzt, bevor jede Behandlung über eine intraartikuläre Injektion verabreicht wurde. Unmittelbar nach der Injektion und alle folgenden 24 Stunden wurde eine intravitale Bildgebung durchgeführt (Anregung 672 nm, Emission 694 nm). Das über die Zeit am Gelenk gemessene Fluoreszenzsignal wurde für jedes Knie auf die anfängliche Messung normiert und ein exponentieller Abfall wurde für jede Probe individuell angepasst. Die AUC/Bioverfügbarkeit für jedes Gelenk wurde aus der am besten passenden Linie des exponentiellen Abfalls berechnet. Nach 7 Tagen wurden die Mäuse eingeschläfert und von jedem Gelenk ein Ex-vivo-Bild aufgenommen, wobei die umgebende Haut entfernt wurde, um die Messempfindlichkeit zu erhöhen.

Die Genexpression wurde mittels TaqMan qPCR im Kniegelenk und im Kniekehlenlymphknoten, der das Kniegelenk entwässert, ausgewertet. Nach der Euthanasie wurden Knie und Kniekehlenlymphknoten entfernt. Kombiniertes Gelenkgewebe aus der Synovialwand und der Gelenkoberfläche (insgesamt nicht mehr als 30 mg) und die Kniekehlenlymphknoten wurden durch Perlenpulverisierung in Qiazol homogenisiert. Die RNA wurde mit dem RNeasy Plus Mini-Kit von Qiagen extrahiert und gereinigt und mit einer NanoQuant-Platte von Tecan in einem Mikroplatten-Reader (Tecan Infinite 500, Tecan) quantifiziert. Die RNA wurde mit dem iScript Synthesis Kit von Bio-Rad (Hercules) in cDNA umgewandelt. Die Genexpression wurde mit der ΔΔCt-Methode berechnet und auf GAPDH und Beta-Actin (ACTB) normalisiert. TaqMan-Reagenzien wurden von ThermoFisher gekauft und gemäß den bereitgestellten Protokollen unter Verwendung geeigneter Primer (IL-12β: Mm01288989_m1, IL-6: Mm01210732_g1, MMP13: Mm00439491_m1, TNF-α: Mm00443258_m1, GAPDH: Mm99999915_g1, ACTB) verwendet : Mm02619580_g1).

Gewebeproben wurden in 10 % Formalin fixiert und 7 Tage lang in 20 % EDTA entkalkt. Ein standardmäßiger 8-Stunden-Zyklus aus abgestuften Alkoholen, Xylolen und Paraffinwachs wurde zur Verarbeitung der Gewebe vor dem Einbetten und Schneiden mit einer Dicke von 5 μm verwendet. Die Schnitte wurden auf positiv geladene Glasobjektträger montiert und mit dem Gemini-Autostainer (ThermoFisher) mit H&E gefärbt. Die Safranin-O-Färbung wurde mit dem StatLab-Färbekit durchgeführt. Die Schnitte wurden mit dem Leica SCN400-Objektträgerscanner abgebildet. Jedes Gelenk wurde anhand von mindestens zwei mittleren Frontalschnitten sowohl auf H&E- als auch auf Safranin-O-Färbungen untersucht. Ein staatlich geprüfter Veterinärpathologe führte histopathologische Untersuchungen unter Blindbedingungen durch38. Die OARSI-Bewertung basierte auf den medialen und lateralen Tibiaplateaus (Skala von 0–6)39, und gleichzeitig wurde eine generische Bewertung auf der Grundlage von H&E-Merkmalen und der Safranin-O-Färbung der Tibiaplateaus gemäß der DJD-Methodik (DJD-Schweregrad, Skala 0–3).

Sechzehn männliche Lewis-Ratten (12–14 Wochen alt, etwa 250 g) wurden von Charles River Laboratories erworben. Die Ratten wurden eine Woche lang an die Wohneinrichtungen der University of Florida gewöhnt. Nach der Akklimatisierung wurden die Ratten einem Gangtest und einem Von-Frey-Verhaltenstest unterzogen. Im Anschluss an die grundlegenden Verhaltenstests erhielten alle Ratten eine Operation am medialen Seitenband plus medialer Meniskusdurchtrennung (MCLT + MMT) an ihrem rechten Hinterbein. Gangdaten wurden in den Wochen 3, 5 und 7 nach der Operation mit einem Phantom Miro Lab320 (Phantom Camera Control 3.0) erfasst, während von Frey-Tests wöchentlich nach der Operation durchgeführt wurden. Acht Wochen nach der Operation erhielten die Ratten eine einseitige Kochsalzlösung oder eine IDO-Gal3-Injektion. Die Ratten wurden am Tag nach der Injektion einem Von-Frey-Test und zwei Tage nach der Injektion einem Gangtest unterzogen. Bis zur Euthanasie wurden wöchentlich sowohl Gang- als auch von-Frey-Daten erhoben.

MCLT + MMT-chirurgische Ratten wurden in einer Schlafbox mit 2,5 % Isofluran (Patterson Veterinary) anästhesiert. Anschließend wurden die Ratten aseptisch mit chirurgischem Betadin-Peeling (Purdue Products) und 70 %igem Ethanol in dreifacher Ausfertigung vorbereitet und auf ein steriles Feld überführt, wobei die Anästhesie durch Maskeninhalation von 2,5 % Isofluran aufrechterhalten wurde. Während der MCLT + MMT-Operation wurde ein 1–2 cm langer Mittellinien-Hautschnitt entlang der medialen Seite des Rattenknies vorgenommen und die Haut zurückgezogen, um das mediale Seitenband freizulegen. Das mediale Seitenband wurde durchtrennt und das Knie in die Valgus-Ausrichtung gebracht, um das mediale Kompartiment zu dehnen und den medialen Meniskus freizulegen. Der mediale Meniskus wurde radial durchtrennt und für den Muskelverschluss wurden resorbierbare 5–0 Vicryl-Geflechtnähte (Ethicon) und für den Hautverschluss 4–0 Ethilon-Nylon-Monofilamentnähte (Ethicon) verwendet. Die Ratten erholten sich postoperativ in einer Wärmebox, bis alle Gliedmaßen belastet wurden. Zur Schmerzbehandlung erhielten Ratten intraoperativ und alle 12 Stunden über 48 Stunden eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,05 mg kg−1) (Patterson Veterinary). Die Ratten wurden in eine Kochsalzinjektionskohorte (n = 7) oder eine IDO-Gal3-Injektionskohorte (n = 8) eingeteilt. 8 Wochen nach der OA-Induktion erhielten Ratten 30 µl einseitige Injektionen von entweder steriler Kochsalzlösung oder IDO-Gal3 (33 pg µl-1) in das operierte Knie unter Verwendung steriler Allergiespritzen (1 ml, 27 G × 3/8) (Becton Dickinson). . Zunächst wurden die Ratten mit 2,5 % Isofluran (Patterson Veterinary) anästhesiert und das operierte Knie wie oben beschrieben aseptisch vorbereitet. Anschließend wurde die Nadel durch das Patellaband der Patellarinne folgend in den Gelenkspalt eingeführt. Das Knie wurde gebeugt und die Injektionsstelle mit steriler Gaze und 70 %igem Ethanol gereinigt.

Die taktile Empfindlichkeit wurde durch Messung der 50-prozentigen Pfotenrückzugsschwelle bestimmt, die mit der Chaplan-Up-Down-Methode für von-Frey-Filamente1 bestimmt wurde. Vor der Operation wurden die Tiere an den Käfig mit Drahtgeflechtboden gewöhnt. Die Ratten wurden in der Woche vor der Operation und 12 Wochen lang wöchentlich nach der Operation einem Von-Frey-Test unterzogen. In Woche 8 wurde den Ratten eine Injektion verabreicht, am folgenden Tag wurden sie einem von-Frey-Test unterzogen. Während des Von-Frey-Tests wurde eine Reihe von Von-Frey-Filamenten (0,6, 1,4, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 15,0 und 26,0 g) auf die Plantarregion jedes Hinterfußes aufgetragen. Zuerst wurde das 4,0 g schwere von Frey-Filament aufgetragen. Ein weniger steifes Filament wurde verwendet, wenn es zu einem Pfotenrückzug kam, und ein steiferes Filament wurde verwendet, wenn es nicht zu einem Pfotenrückzug kam. Anhand dieser Daten wurde mithilfe der Chaplan-Näherung1 die Kraft berechnet, bei der sich Ratten mit gleicher Wahrscheinlichkeit zurückziehen oder tolerieren würden.

Im Handel erhältliche Streptavidin-funktionalisierte Partikel (Dynabeads MyOne Streptavidin C1, 65001; Life Technologies) wurden mit biotinylierten Antikörpern für CTXII (AC-08F1, ImmunoDiagnostic Systems), IL-6 und MCP1 (517703 und 505908, Biolegend) beschichtet. Hier wurden die Partikel dreimal in PBS gewaschen und 2 Stunden lang auf einem Röhrchenrevolver bei Raumtemperatur in Antikörpermischungen inkubiert, die entweder 8,9 ng µl-1 Anti-CTXII, 8,9 ng µl-1 Anti-IL-6 oder 357 ng µl enthielten −1 Anti-MCP1 und dann über Nacht zur statischen Inkubation bei 4 °C gebracht. Anschließend wurden die Partikel dreimal in PBS mit 2 % BSA und 2 mM EDTA (Einfangpuffer) gewaschen, wobei die endgültigen Antikörpermengen pro Partikel 0,33 ng Ab µg−1 Partikel (Anti-CTXII) und 0,33 ng Ab µg−1 Partikel betrugen (Anti-IL-6) und 13,0 ng Ab µg−1 Partikel (Anti-MCP1).

Nach der Euthanasie durch Ausbluten wurde eine magnetische Erfassung sowohl am operierten als auch am kontralateralen Knie durchgeführt, wie zuvor beschrieben40. Kurz gesagt, 300 µg Antikörper-konjugierte Magnetpartikel (gleiche Teile für jeden Partikeltyp) wurden in 10 µl Kochsalzlösung suspendiert und dann in das operierte und kontralaterale Knie injiziert. Nach 2-stündiger Inkubation im Knie wurden die Partikel durch 5 wiederholte 50-μl-PBS-Waschvorgänge des Knies gesammelt, wobei die gesammelte Flüssigkeit vereinigt und die Partikel in der Flüssigkeit über einen Magnetabscheider isoliert wurden. Die gesammelten Partikel wurden zweimal mit Einfangpuffer gewaschen und dann 15 Minuten lang in 100 mM Glycin-Tris-Puffer (pH 3,1), der 2 % BSA und 2 mM EDTA (Freisetzungspuffer) enthielt, inkubiert. Nach der Freisetzung des Biomarkers wurden magnetische Partikel durch magnetische Trennung isoliert und der pH-Wert des Überstands für Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) auf 8,3 eingestellt. CTXII wurde dann im Überstand unter Verwendung des Cartilaps CTXII ELISA-Kits (AC-08F1, ImmunoDiagnostic Systems Cartilaps Kit) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen und CCL2 wurde unter Verwendung eines Ratten-CCL2-ELISA-Kits (KRC1012 Life Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers und zuvor beschrieben quantifiziert Modifikationen41. IL-6 wurde mithilfe eines im Labor entwickelten ELISA unter Verwendung von Biotin-Anti-Ratten-IL-6-Antikörper (517703) und gereinigtem (Beschichtungs-) Anti-Ratten-IL-6-Antikörper (517701, Biolegend) quantifiziert. Der Beschichtungsantikörper wurde in 100 mM NaHCO3 und 34 mM Na2CO3 (pH 9,5) verdünnt, in beschichtete Mikrovertiefungen (Nunc MaxiSorp, 434797; ThermoFisher) gegeben, 30 Minuten lang auf einem Plattenschüttler und dann über Nacht bei 4 °C inkubiert und fünfmal mit PBS gewaschen mit 0,5 % Tween-20 (Waschpuffer), 1 Stunde lang mit PBS mit 2 % BSA und 10 % wärmebehandeltem Rinderserum blockiert und schließlich fünfmal mit Waschpuffer gewaschen. Proben und Standards wurden mit Anti-IL-6-Nachweisantikörper vorinkubiert (30 Minuten bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4 °C), dann auf eine ELISA-Platte gegeben und 3 Stunden lang inkubiert. Die Platte wurde dann fünfmal gewaschen und 100 μl Avidin-HRP (405103, Biolegend, 500-fach verdünnt in 2 % BSA und 10 % wärmebehandeltem Rinderserum) wurden zur Platte gegeben und 30 Minuten lang inkubiert. Die Platte wurde erneut fünfmal gewaschen, wobei 100 μl Tetramethylbenzidin-Substrat für 15 Minuten zugegeben wurden, gefolgt von 100 μl Stopplösung (verdünnte Schwefelsäure). Die Absorption wurde bei 450 und 650 nm abgelesen. Die Partikel wurden in 60 μl Einfangpuffer quantifiziert, wobei die Absorption der Partikelsuspensionen bei 450 nm mit dem Synergy 2 Multi-Mode-Mikroplattenlesegerät wie zuvor beschrieben40 gemessen wurde.

Nach der magnetischen Erfassung wurden die operierten und kontralateralen Knie seziert und 48 Stunden lang bei Raumtemperatur in 10 % neutral gepuffertes Formalin (ThermoFisher) gelegt. Nach der Fixierung wurden die Knie 5 Tage lang bei Raumtemperatur mit Cal-Ex (ThermoFisher) entkalkt, über eine Ethanolleiter dehydriert und mittels Vakuuminfiltration in Paraffinwachs eingebettet. Anschließend wurden Frontalschnitte von 10 µm aufgenommen, wobei alle 100 µm mindestens ein Schnitt durch den Belastungsbereich des medialen Meniskus gemacht wurde. Die Objektträger wurden mit Toluidinblau gefärbt.

Sechzehn männliche Lewis-Ratten (12–14 Wochen alt, etwa 250 g) wurden von Charles River Laboratories erworben. Die Ratten wurden eine Woche lang an die Wohneinrichtungen der University of Florida gewöhnt. Anschließend wurden die Ratten einer MCLT + MMT-Operation unterzogen. Nach 8 Wochen erhielten die Ratten eine 50-µl-Injektion von entweder Nano-Glo Luciferase (NL) oder Nano-Glo Luciferase Galectin-3 (NL-Gal3). Ratten wurden unmittelbar nach der Injektion und dann 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24 und 28 Tage nach der Injektion mit IVIS abgebildet. Nach der Bildgebung am 28. Tag wurden die Ratten eingeschläfert und sowohl die operierten als auch die kontralateralen Knie wurden zur Analyse der Gelenkgewebeverteilung über IVIS präpariert. In vivo wurde die Gelenkretention im operierten und kontralateralen Knie von 16 männlichen Lewis-Ratten gemessen. 8 Wochen nach der MCLT + MMT-Operation wurden die Knie aseptisch vorbereitet und die Ratten erhielten bilaterale Injektionen von NL (50 µl, 3,27 µM) (n = 8) oder bilaterale Injektionen von NL-Gal3 (50 µl, 3,27 µM) (n = 8). ) sowohl im operierten als auch im kontralateralen Knie. (Operationen und Injektionen wurden auf die gleiche Weise wie oben beschrieben durchgeführt). Die Knie wurden gebeugt, dann wurden 50 µl Furimazin (50 µl, 1:50 Verdünnung in PBS) injiziert. Unmittelbar nach der Injektion wurden die Knie wieder gebeugt und die Lumineszenz wurde mit IVIS unter Verwendung einer Belichtungszeit von 1 s (und 60 s) im Sichtfeld D gemessen. Furimazin-Injektionen und IVIS-Bildgebung wurden bei 1, 2, 4, 8, 12, 16 wiederholt , 20, 24 und 28 Tage nach der NL- oder NL-Gal3-Injektion. Zur Analyse wurde ein ROI um das größte Lumineszenzsignal gezeichnet und kopiert, um einen ROI mit identischer Größe für alle Knie zu erstellen.

Nach der Bildgebung am 28. Tag wurden die Ratten mittels Herzpunktion unter tiefer Isoflurananästhesie eingeschläfert. Die Knie wurden präpariert, um das Patellagewebe, das Schienbeingewebe, das Oberschenkelgewebe und den Meniskus zu isolieren. Das Patellagewebe umfasste die Patella, die Patellasynovia und das Fettpolster. Das Schienbeingewebe umfasste das Schienbein und die daran befestigte Synovia. Das Femurgewebe umfasste den Femur und die daran befestigte Synovia. Die Gewebe wurden in Platten mit 24 Vertiefungen gegeben und mit Furimazin (1:50-Verdünnung in PBS) etwa 1 Minute lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Gewebe aus den 24-Well-Platten entnommen und die Lumineszenz mit IVIS unter Verwendung automatischer Belichtung im Sichtfeld C gemessen. Zur Beurteilung wurden einzelne ROIs um das Patellagewebe, das Schienbeingewebe, das Femurgewebe und den Meniskus gezeichnet. Der ROI für jedes Gewebe wurde kopiert, um einen ROI mit identischer Größe für das jeweilige Gewebe zu erstellen.

Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism 8 und 9 durchgeführt, mit den folgenden Ausnahmen. Daten zu chirurgisch bedingter Arthrose wurden mit R Analytics 4.0.4 mit RStudio 2022 analysiert und MATLAB 2020b wurde für Mann-Whitney-U-Tests zu Psoriasis-Daten verwendet. Über studienspezifische Analysen wird in den Bildunterschriften berichtet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die wichtigsten Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und seinen ergänzenden Informationen verfügbar. Die Quelldatensätze sind für Forschungszwecke auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Die Codes für die Gangdatenanalyse sind unter https://github.com/OrthoBME, https://github.com/OrthoBME/GAITORsuite und https://github.com/OrthoBME/GEKO verfügbar.

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BGK, SMW und GAH geben bekannt, dass sie die in dieser Studie beschriebene Forschung von den National Institutes of Health (R01 DE027301) unterstützen. BGK gibt die Unterstützung durch die National Institutes of Health bekannt (R01 DK091658 und R01 DK098589). GAH gibt die Unterstützung durch die National Institutes of Health (R03 EB019684 und R35 GM133697) und die National Science Foundation (DMR-1455201) bekannt. BGK und DA geben die Unterstützung durch die National Institutes of Health bekannt (R01 AI133623). KDA gibt die Unterstützung durch die National Institutes of Health bekannt (R01 AR068424 und R01 AR071431). CLD gibt Unterstützung durch das Verteidigungsministerium bekannt (CDMRP OR130302). SAF gibt die Unterstützung durch die National Institutes of Health bekannt (UL1TR001427 und TL1TR001428). AJK gibt Unterstützung durch die National Institutes of Health bekannt (T32 DK108736).

Die folgenden Autoren trugen gleichermaßen bei: Evelyn Bracho-Sanchez, Fernanda G. Rocha, Sean K. Bedingfield, Brittany D. Partain und Sabrina L. Macias.

J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, Gainesville, FL, USA

Evelyn Bracho-Sanchez, Brittany D. Partain, Sabrina L. Macias, Maigan A. Brusko, Margaret M. Fettis, Shaheen A. Farhadi, Kevin Koenders, Alexander J. Kwiatkowski, Antonietta Restuccia, Bethsymarie Soto Morales, Arun Wanchoo, Kyle D Allen, Gregory A. Hudalla und Benjamin G. Keselowski

Abteilung für Oralbiologie, College of Dentistry, University of Florida, Gainesville, FL, USA

Fernanda G. Rocha & Shannon M. Brieftasche

Abteilung für Biomedizintechnik, Vanderbilt University, Nashville, TN, USA

Sean K. Bedingfield und John M. Collazo

Abteilung für Anatomie und Zellbiologie, College of Medicine, University of Florida, Gainesville, FL, USA

Eric Y. Helm und Craig L. Duvall

H. Lee Moffitt Cancer Center und Forschungsinstitut, Tampa, FL, USA

Dorina Avram

Abteilung für orale und kraniofaziale Gesundheitswissenschaften, Adams School of Dentistry, Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, USA

Shannon M. Brieftasche

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EB-S., FGR, BDP, SKB, SLM und AJK trugen zur Gestaltung der Arbeit sowie zur Erfassung, Analyse und Interpretation der Daten bei. AR, MMF, SAF, EYH, JMC, KK, MAB, BSM und AW trugen zur Datenerfassung und -analyse bei. DA trug zur Gestaltung der Arbeit sowie zur Analyse und Interpretation der Daten bei. CLD, KDA und SMW trugen zur Gestaltung der Arbeit sowie zur Analyse und Interpretation der Daten bei und überarbeiteten das Manuskript inhaltlich. BGK und GAH konzipierten und leiteten die Arbeit, trugen zur Gestaltung der Arbeit bei, trugen zur Analyse und Interpretation der Daten bei und verfassten das Manuskript. Alle Autoren haben zum eingereichten Manuskript beigetragen und es genehmigt.

Korrespondenz mit Gregory A. Hudalla oder Benjamin G. Keselowsky.

BGK und GAH sind Gründer, halten Aktien und sind im wissenschaftlichen Beirat von Anchor Biologics, Inc. tätig. Die University of Florida befasst sich mit Molekülen und deren Verwendung, über die in diesem Artikel berichtet wird. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Biomedical Engineering dankt Ursula Grohmann, Gabriel A. Rabinovich und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Ergänzende Methoden und Abbildungen.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Bracho-Sanchez, E., Rocha, FG, Bedingfield, SK et al. Unterdrückung lokaler Entzündungen durch Galectin-verankerte Indoleamin-2,3-Dioxygenase. Nat. Biomed. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01025-1

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Eingegangen: 08. Juli 2021

Angenommen: 16. März 2023

Veröffentlicht: 01. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01025-1

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Naturbiomedizinische Technik (2023)